Sciencemag.cz
Doporučujeme
Technika navržená na MITu umožňuje dodávat geny dlouhé až 36 000 párů bází DNA do několika typů lidských buněk a také do jaterních buněk myší. Nová technika by mohla být účinná pro léčbu nemocí, které jsou způsobeny defektními geny s velkým počtem mutací, jako je například cystická fibróza. Genová terapie tak může konečně sloužit k nahrazování celých genů, nikoliv jednotlivých mutací, uvádějí autoři studie. Takový byla také původní myšlenka genové terapie, jen dlouho uvízla na půl cesty.
Nový nástroj kombinuje přesné zacílení CRISPR-Cas9 (technika odvozená z bakteriálních obranných systémů) s integrázami, které viry používají k vložení vlastního genetického materiálu do bakteriálního genomu. Vlastně tak tedy využívá metody obou stran války mezi bakteriemi a bakteriofágy.
Systém editování genů CRISPR-Cas9 se skládá z enzymu Cas9, který stříhá DNA, a krátkého řetězce RNA, který navádí enzym na určitou oblast genomu a určuje místo zásahu. Když se Cas9 a naváděcí RNA zaměřená na nežádoucí gen dostanou do buněk, v genomu se vytvoří specifický řez a buňky jej slepí zpět, přičemž často dojde k odstranění malé části genomu. Pokud je dodána také šablona DNA, mohou buňky během procesu opravy začlenit do svého genomu opravenou kopii. Tento proces však vyžaduje, aby buňky vytvořily ve své DNA dvouřetězcové zlomy, které mohou způsobit chromozomální delece nebo celkově škodlivé přestavby genomu. Dalším omezením je, že vše funguje pouze u buněk, které se dělí, protože jenom ty mají aktivovány procesy opravy DNA.
Tým MIT chtěl vyvinout nástroj, který by dokázal vyříznout vadný gen a nahradit ho novým, aniž by vyvolal dvouřetězcové zlomy DNA. Právě za tímto účelem byly použity integrázy. V této studii se vědci zaměřili na serinové integrázy, které mohou vkládat obrovské kusy DNA, dlouhé až 50 000 párů bází. Tyto enzymy se ovšem normálně připojují pouze na velmi specifická místa („přistávají místa“, landing pads) genomu, takže samy o sobě se prakticky nedají využívat pro léčbu. Přesné zacílení však umožňuje jejich kombinace s CRISPR-Cas9. Nový nástroj PASTE (Programmable Addition via Site-specific Targeting Elements) nejprve na libovolné místo v genomu vloží pomocí CRISPR-Cas9 přistávací místo (to lze, protože přistívací místo v tomto obsahuje jen 46 párů bází DNA, tj. je dostatečně krátké). Příslušnou operaci lze pomocí dalších triků přitom provést bez dvouřetězcového zlomu. Poté již může zafungovat integráza a vloží na příslušném místě do genomu svůj mnohem větší náklad DNA.
V nové studii vědci ukázali, že pomocí PASTE mohou vkládat geny do buněk jater myší a do několika typů lidských buněk, včetně jaterních buněk, T-buněk a lymfoblastů (nezralých bílých krvinek). Testovali doručovací systém s 13 různými geny, včetně některých, které by mohly být terapeuticky užitečné, a dokázali je vložit do devíti různých míst v genomu. Díky absenci dvouřetězcových zlomů byl zásahy spojené jen s minimem chyb.
Dosud se podařilo takto vložit 36 000 párů bází, ale podle autorů studie by mělo jít použít i delší sekvence. Lidský gen může mít délku od několika stovek do více než 2 milionů párů bází, ovšem pro terapeutické účely obvykle stačí použít pouze části kódující sekvenci proteinu, což velikost potřebného úseku DNA podstatně snižuje.
Vědci nyní zkoumají především možnost využití tohoto nástroje jako možného způsobu náhrady defektního genu pro cystickou fibrózu. Nová technika by mohla být užitečná také při léčbě krevních chorob způsobených vadnými geny, jako je hemofilie a nedostatek G6PD, nebo Huntingtonovy choroby.
Omar Abudayyeh, Drag-and-drop genome insertion of large sequences without double-strand DNA cleavage using CRISPR-directed integrases, Nature Biotechnology (2022). DOI: 10.1038/s41587-022-01527-4. www.nature.com/articles/s41587-022-01527-4
Zdroj: Massachusetts Institute of Technology / Phys.org
