Sciencemag.cz
Doporučujeme
Objev zvláštní proteinové struktury a snaha o její potvrzení vedly k popsání interakčních shluků receptorů na NK buňkách. Studie výzkumného týmu Dr. Ondřeje Vaňka z katedry biochemie Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy a jeho kolegů z BTÚ AV ČR (BIOCEV) byla nedávno publikována v prestižním časopise Nature Communications.
V Laboratoři strukturní biochemie imunitního rozpoznávání, kterou vede doktor Ondřej Vaněk, vznikl zajímavý příběh. Všechno začalo před několika lety pozorováním nečekané proteinové struktury receptoru a skončilo detailním popisem některých struktur a interakcí imunitního systému. „Zajímá nás, jakým způsobem buňky imunitního systému rozeznávají, jestli jsou jiné buňky v našem těle zdravé nebo nezdravé (nádorové, virem napadené, stresované, či nějakým způsobem poškozené),“ přibližuje Dr. Vaněk. Jeho výzkumný tým se zaměřuje především na NK buňky (z anglického natural killer cells), které jsou součástí vrozené imunity a pokud seznají, že jiná buňka v těle není v pořádku, mají schopnost ji poměrně rychle zabít. Strukturní imunologie se zde snaží odhalit, jakým způsobem receptory na povrchu buněk imunitního systému rozpoznávají proteiny (nebo jiné struktury) na povrchu jiné buňky. „Tyto proteiny NK buňce řeknou, zda je nebo není vše v pořádku. To, co se nakonec stane, není jen o interakci dvou proteinů, ale jedná se souhru celé řady interakcí a nakonec převáží buď inhibiční, nebo aktivační signál,“ popisuje Dr. Vaněk.
Právě publikovaná práce se zaměřuje na dva proteiny a jejich interakci. Jedním z nich je receptor na NK buňkách, označovaný jako NKR-P1. Tento receptor je zajímavý mimo jiné tím, že byl objeven již v 80. letech, nejprve u myši a jen o málo později u člověka, a dodnes slouží jako jeden z hlavních povrchových znaků, jímž lze NK buňky definovat. Zatímco u hlodavců těchto NKR-P1 proteinů najdeme více (jsou polymorfní), u člověka byl popsán jen jeden a jeho struktura dosud nebyla známa. U NK buněk je funkce receptoru NKR-P1 inhibiční, avšak najdeme ho i na povrchu některých specifických subpopulací T lymfocytů, které jsou skloňovány v souvislosti s celou řadou autoimunitních onemocnění a v tomto kontextu není zatím jeho působení moc dobře popsáno. Pravděpodobně se mění z čistě inhibičního na kostimulační a přispívá tak k rozvoji těchto onemocnění.
Druhým proteinem, na který se studie zaměřuje, je ligand receptoru NKR-P1, protein LLT1. Tento protein se za normálních okolností vyskytuje na dalších buňkách imunitního systému a jak popisuje Dr. Vaněk: „Při interakci a vzájemném osahání povrchu si díky němu buňky řeknou, že o sobě ví a všechno je v pořádku.“ Posledních patnáct let se však ukazuje, že v řadě případů nádorového bujení je protein LLT1 exprimován na povrchu rakovinných buněk. Pod evolučním tlakem buněk imunitního systému se nádor snaží najít nějakou cestu, jak uniknout imunitnímu dohledu. V tomto případě začaly rakovinné buňky na svém povrchu exprimovat protein LLT1, aby inhibovaly imunitní odpověď. „Bohužel platí, že čím horší typ nádoru, tím více nacházíme povrchovou expresi proteinu LLT1. Mohli bychom říci, že se jedná o špatný prognostický marker – když nalezneme tento protein, není to úplně dobrý signál, protože pro imunitní systém bude pravděpodobně těžší se s nádorem vypořádat,“ dodává Dr. Vaněk. Strukturu LLT1 popsal společně s kolegy jako první v roce 2015.
Článek popisuje oba proteiny a jejich interakci na mnoha rovinách – od atomární struktury až po rovinu buňky. Výzkumný tým nejdříve vyrobil příslušné proteiny, vykrystalizoval a popsal strukturu jejich komplexu. „Výsledek byl poměrně nečekaný a zajímavý. Člověk si v tu chvíli říká, zda je to jenom artefakt krystalu, nebo taková struktura na povrchu buňky opravdu existuje.“ popisuje Dr. Vaněk. Dalším, poměrně složitým, krokem výzkumu byla superrozlišovací mikroskopie. Studovaný proteinový komplex má totiž poměrně nízkou afinitu a tak už jenom pozorovat tuto interakci v roztoku nebylo jednoduché. Následující fáze výzkumu probíhaly na povrchu buňky a na živých buňkách izolovaných z krve dárců. Díky kombinaci mnoha metod dokázal výzkumný tým ověřit předchozí pozorování v krystalové struktuře komplexu obou proteinů a popsat z toho vyplývající funkční konsekvence – za jakých podmínek se spolu musí proteiny NKR-P1 a LLT1 potkat, aby vznikl inhibiční signál. Jeden ze spoluautorů studie, Denis Cmunt, nyní PhD. student na Univerzitě Lausanne, popisuje: „Nejzajímavější bylo propojení dat na různých úrovních. Bylo krásné vidět, jak do sebe vše nakonec zapadlo, jak byla biofyzikální pozorování učiněná na molekulárních systémech potvrzena i v pokusech s buňkami.”
Receptor NKR-P1 i jeho ligand LLT1 jsou homodimery, to znamená, že se na povrchu dané buňky nachází vždy dva stejné řetězce, spojené pomocí disulfidických můstků. Dosud platila představa, že při vzájemné interakci obou proteinů váže jeden dimer receptoru jeden dimer ligandu. Díky krystalové struktuře komplexu NKR-P1 s LLT1 však víme, že to není pravda: polovina dimeru receptoru interaguje s polovinou dimeru ligandu. Vzniká tak síť vzájemně provázaných molekul, která evokuje možnost existence vazebných shluků těchto molekul na povrchu NK buňky při její interakci s buňkou cílovou. Ověřit tuto hypotézu však nebylo úplně triviální a potvrdit ji od atomu až na úroveň buňky trvalo několik let usilovného výzkumu, do kterého se zapojila i celá řada studentů. Afinita studovaných proteinů je velmi slabá a teprve díky využívání dvou různých interakčních povrchů a shlukování dimerů zesílí natolik, aby NK buňka vzala inhibiční signál v potaz. Nezbytnost setkání většího počtu molekul je tak jakousi evoluční ochranou před zbytečnými či falešnými podněty a díky nové studii přesně vidíme, jak tato interakce na strukturní úrovni funguje. Detailní popis strukturních a funkčních vlastností pak teoreticky umožňuje navrhnout terapeutické proteiny, které by mohly do výše popsaného systému uměle zasáhnout a žádoucím způsobem ovlivnit interakci imunitního systému a nádorových buněk. Například by mohly od nádorové buňky k NK buňce vyslat úplně opačný signál a místo inhibice aktivovat programovanou buněčnou smrt.
Studie vznikla v pracovní skupině Dr. Ondřeje Vaňka na Přírodovědecké fakultě Univerzity Karlovy ve spolupráci s týmem Dr. Jana Dohnálka z BTÚ AV ČR (BIOCEV), který se podílel především na strukturních analýzách. K výzkumu významně přispěli také dva pracovníci z Univerzity v Oxfordu, kde probíhala krystalizace a měření rentgenové difrakce. „Z naší laboratoře se na této studii podílelo několik generací studentů a její první autor, Jan Bláha, na tomto výzkumu udělal doktorát. Postupně jsme se učili další a další metody a studenti se díky tomu opravdu hodně posunuli. Někteří z nich teď pracují na špičkových evropských pracovištích.“ vysvětluje Dr. Vaněk a dodává: „Za mě je to skutečně velká část toho příběhu, protože kdyby v naší laboratoři nebyli nadaní studenti, kteří do toho dali kus života a sebe, tak já sám bych toho mnoho nedokázal.“
Jan Bláha, první autor studie a nyní postdoktorand v EMBL Hamburk k výzkumu dodává: „Při práci na tomto projektu pro mě bylo nejzajímavější objevovat nové poznatky v relativně běžných datech, které nás vedly ke složitějším experimentům, které tyto poznatky potvrdily. Naučil jsem se nebát se následovat vlastní bláznivé myšlenky, pokud se opírají o získaná data. Pochopil jsem, že řada světových odborníků jsou jenom lidé, a ti nejzapálenější jsou hraví a ochotní pomoci s každou bláznivou vědeckou myšlenkou.“
Další klíčová spoluautorka, Barbora Kalousková, která nyní působí jako postdoktorandka na Technické Univerzitě ve Vídni, výroky svých kolegů dále rozvádí: „Nejtěžší bylo prokousat se přes prvotní neúspěchy k fungujícím a reprodukovatelným výsledkům. Občas je těžké odlišit, jestli experiment nefunguje kvůli špatnému nastavení nebo pro to, že je základní hypotéza špatná a tedy nikdy ani fungovat nemůže. To byl hlavně problém při optimalizaci pro nás do té doby nových metod, jako byla superrozlišovací mikroskopie a cytotoxické testy s primárními NK buňkami. Myslím, že jsem se díky této studii naučila hledat cesty. A to ve smyslu ne těch nejjednodušších, ale naopak složitějších, i když stále schůdných. Máme kolem sebe až překvapivé množství špičkově vybavených pracovišť, stačí jen najít ty správné přístroje a oslovit jejich šikovné operátory. Nebo se to prostě naučit a operovat s přístrojem sám. A nebát se mezioborové spolupráce.“
Vedoucí Laboratoře struktury a funkce biomolekul, Dr. Jan Dohnálek z Biotechnologického ústavu AV ČR, komentuje strukturní analýzu projektu: „Strukturní evidence tvorby komplexu si vyžádala důkladnou analýzu dat, což podtrhuje nezbytnost vysoké úrovně strukturní epxpertízy pro takový projekt. Není bez zajímavosti, že náznaky strukturních výsledků ohledně klastrování receptorů a ligandů se jevily jako obtížně prokazatelné a obhajitelné, co se týká jejich biologického významu. Bylo to ale nakonec díky velkému úsilí spolupracovníků z Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy, že se podařilo prokázat i jejich biologický význam.“
Bláha J., Skálová T., Kalousková B., Skořepa O., Cmunt D., Grobárová V., Pazicky S., Poláchová E., Abreu C., Stránský J., Kovaľ T., Dušková J., Zhao Y., Harlos K., Hašek J., Dohnálek J., Vaněk O. (2022): Structure of the human NK cell NKR-P1:LLT1 receptor:ligand complex reveals clustering in the immune synapse. Nature Communications 13(1): 5022. DOI: 10.1038/s41467-022-32577-6
