Sciencemag.cz
Doporučujeme
Již nějakou dobu víme, že funkci enzymu dokáže vedle proteinů zastávat i RNA. Ukazuje se ale, že podobnou aktivitu může vykazovat i samotná DNA. Jak tyto enzymy v záplavě možných sekvencí DNA hledáme? Co z existence deoxyribozymů (DNAzymů) dále vyplývá např. pro evoluční biologii a jaké může být jejich využití?
Na otázky odpovídá Tereza Streckerová, doktorandka Ústavu organické chemie a biochemie AV ČR ze skupiny E A. Curtise, která se zaměřuje na hledání a charakterizaci netradičních struktur a funkcí nukleových kyselin (DNA i RNA).
Mají DNAzymy nějaký vztah k hypotetickému RNA světu a počátkům biologické evoluce? Mám tím na mysli, že pokud může být enzymaticky aktivní DNA, tak vlastně hypotézu RNA světa ani nepotřebujeme…?
Pro evoluční biologii DNAzymy pravděpodobně nic moc neznamenají. Pokud vím, žádný přírodní DNAzym dosud nebyl objeven a jedná se tak prozatím o čistě syntetické molekuly. Ty tedy jasně dokazují, že DNA má potenciál umožnit některé chemické reakce, nicméně zatím neznáme případ, že se to samovolně dělo. RNA je tvárnější (tzn. je „náchylnější“ k tomu, aby funkční struktury tvořila) a méně stabilní, což jí paradoxně z hlediska evoluce pomáhá – díky větší tendenci k chybám je u ní evoluce rychlejší, protože mnohem častěji vznikají nové varianty. V přírodě má DNA a RNA jiné chování a to, že by se DNA sama vyvíjela jako katalyticky funkční molekula, není příliš pravděpodobné.
Proč se potom na DNAzymy soustředí chemici?
Pro naše potřeby je v konkrétních případech využití DNA se speciálními funkcemi proti RNA výhodnější hned z několika důvodů; DNA je mnohem snadnější objednat a nasyntetizovat, je to také mnohem levnější, jedná se o řádově stabilnější molekulu a i práce s ní je při selekcích rychlejší – dokážeme ji, na rozdíl od RNA, namnožit přímo (RNA musíme nejdřív přepsat na DNA, tu namnožit, vyčistit a přepsat zase do RNA). S DNA se tedy lépe pracuje jak při výzkumu a vývoji, tak potom i při jejím dalším použití.
Kdy se vlastně přišlo na to, že rovněž DNA může vykazovat enzymatickou aktivitu?
Článek o existenci DNAzymu byl poprvé publikován v roce 1994 (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9383394/), tedy přibližně desetiletí po objevu ribozymů (katalytických struktur RNA). Jednalo se – tehdy – o strukturu DNA, která byla schopná štěpit RNA. Tedy přesně to samé, o čem pojednává náš nedávný článek.
Viz také: Jak snadno a rychle objevit DNA s novými funkcemi
Tento původní DNAzym nás k našim experimentům inspiroval. Jeho struktura a mechanismus totiž byly za ta léta dobře prostudovány a postupem času se přišlo na to, že jeho funkční část je na běžné poměry katalytických nukleových kyselin dost malá – v minimálním případě se jednalo o řetězec pouhých 13 nukleotidů. My jsme chtěli vyzkoušet, jestli je technicky možné najít funkční strukturu DNA pouze v jednom kroku selekce. (To je metoda, kterou se funkční motivy běžně hledají – vygeneruje se knihovna s obrovským množstvím náhodných sekvencí a v mnoha iteracích se pak hledá nějaká, která by měla požadovanou funkci. My jsme chtěli zjistit, jestli je možné udělat celý proces pouze v jediné takové iteraci.) Byli jsme si ale vědomi, že takovýto postup zase bude mít své limity, mj. v tom, že funkční motiv bude muset být dostatečně krátký. Protože jsme chtěli validovat metodu spíše než nalézt novou a užitečnou funkční strukturu, inspirovali jsme se právě tímto historickým článkem a snažili se nalézt funkční motiv DNA se stejnou schopností, tedy štěpit RNA. Předpokládali jsme totiž, že pro takovouto funkci máme vysokou pravděpodobnost, že se nám mezi krátkými sekvencemi něco podaří najít a tím budeme schopni metodu validovat a určit, jak dobře může fungovat. Což se povedlo – jednak jsme dokázali, že naše metoda fungovat může, jednak jsme u ní pro náš případ byli schopní stanovit některé charakteristiky a meze. A jako příjemný bonus jsme dostali i jiný konkrétní strukturní motiv, než byl dosud známý. Takže jsme vlastně i objevili a popsali něco nového, co funguje srovnatelně dobře jako původní DNAzym, jen postup k tomu vedoucí byl mnohem méně pracný.
Předpokládám, že DNA je enzymaticky aktivní v jednovláknové formě, jako dvojšroubovice je již prostě „datové médium“?
Ano, jakmile DNA vytvoří stabilní dvojšroubovici, v této formě je již v prostoru fixována a katalyticky aktivní nebude. Nicméně i katalyticky aktivní struktury mají zpravidla krátké úseky, kde dochází k párování bází. Často také ve strukturách těchto aktivních molekul vídáme, že obsahují takzvané G-kvadruplexy, což jsou zvláštní krátké „uzly“ na DNA s vysokým obsahem guaninu. Výjimečně v nich třeba vidíme i krátké úseky trojité šroubovice.
Dá se říct, že enzymatickou aktivitu vykazuje vždy kousek DNA (kolik cca nukleotidů?) a na zbytku molekuly nezáleží (maximálně když je dlouhá molekula s tou požadovanou sekvencí, tak je rozdíl v tom, že pak je méně účinné?), nebo jsou enzymaticky aktivní jen krátké molekuly DNA?
To je otázka, na kterou se těžko odpovídá v obecném smyslu. V našem případě jsme například vytvoření aktivního motivu pomohli tím, že jsme ho vsadili do takového „držáčku“ a otevřeli mu dveře k místu, kde byla RNA a kde docházelo ke štěpení. To celé bylo tvořeno právě jen jednou delší sekvencí DNA s jednou RNA bází v konkrétním místě. Tím jsme si zajistili, že aktivní motiv své místo působení pohodlně najde. Všeobecně je okolí motivu, který se hledá, trochu alchymie. Pro zjednodušení předpokládáme, že pokud je okolí aktivního motivu nějaká náhodná sekvence, pak na ní příliš nezáleží. Nicméně ani to bohužel není pravda vždy – často dochází k zeslabení funkčnosti tím, že se celá molekula v prostoru trochu jinak sbalí. Nebo se může stát, že je ten aktivní motiv zabalený do zbytku DNA tak, že se k němu vlastně zamezí přístup.
To, jak dlouhá má aktivní sekvence být, nikdy nevíme dřív, než ji najdeme. Zároveň také nikdy předem nevíme, jaké požadavky na své okolí bude aktivní sekvence mít, a neznáme tedy předem ani ideální způsob, jak celý konstrukt navrhnout. Jak dlouhé mají/musejí být aktivní sekvence z hlediska délky, k tomu také nemáme žádnou obecnou teorii. Pokud vím, naše dvanáctinukleotidová DNA bude asi nejkratší známá struktura s definovanou a specifickou katalytickou aktivitou. Všeobecně hledáme a nacházíme aktivní DNA motivy v délkách kolem 50 nukleotidů. Nicméně to je zase proto, že v delších sekvencích moc efektivně hledat neumíme, a tak zde po aktivních sekvencích ani nepátráme, i když se zde nejspíš vyskytovat budou.
K čemu DNA enzymy potenciálně jsou, kromě základního výzkumu?
Teoreticky k čemukoli, kde si dokážete představit využití enzymů obecně. S tím rozdílem, že DNA je mnohem jednodušší na výrobu a nepotřebuje tak moc zacházení v rukavičkách jako proteinové enzymy. Prozatím se DNAzymy někde uplatňují jako senzory, potenciál mají pro medicínské využití, jako katalyzátory pro molekulární biologii a dost možná v budoucnu i pro průmysl.
V medicíně mají největší šanci umělé deriváty nukleových kyselin, kde jsou nukleotidy specificky lehce modifikovány tak, aby byly schopné vytvářet funkční struktury, ale navíc byly zároveň stabilní v krevním oběhu či v buňkách. „Obyčejná“ DNA či RNA by byla v těle rozštěpena dřív, než by mohla začít plnit svou funkci.
